Tetramery MHC klasy II identyfikują specyficzne dla peptydu ludzkie limfocyty T CD4 + proliferujące w odpowiedzi na antygen grypy A ad

W drugiej rundzie amplifikacji jako produkt początkowy (+) na pN15LZ użyto produktu pierwszej rundy. szablon, który zawiera podstawowy motyw cDNA LZ, w stężeniu 10 pM, w celu utworzenia chimery DRA1 / LZ (pN15LZ . i pN15LZ . były prezentami D. Ostrov i S. Nathenson, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, USA). Para primerów (+) 5. -AGAATTCATGGCCATAAGTGGAGTCCC-3. i (.) 5a-CTGGTACCATCCTACTGGGCGAGTT-3. (homologia dzieląca się z 3. końcem podstawowego LZ), została następnie użyta do amplifikacji chimery. Fragment poddawano klonowaniu TA w pCR2.1-TOPO (Invitrogen Corp., San Diego, Kalifornia, USA), sekwencjonowano, a następnie subklonowano do indukowalnego Cu wektora ekspresyjnego Drosophila pRmHa-3 (podarunek od LSB Goldstein, Howard Hughes Medical Institute , LaJolla, Kalifornia, USA) z zastosowaniem miejsc EcoRI i KpnI zaprojektowanych do gruntowania drugiej rundy (podkreślono). W celu wytworzenia rozpuszczalnego łańcucha DRB1, cDNA DRB1 * 0401 został amplifikowany w pierwszej rundzie przy użyciu pary starterów (+) 5a-ACTCGAGCCATGGTGTGTCTGAAGTTCCC-3. i (.) 5. -CCAGGTCTGCTGACGACTTGCTCTGT-3. (homologia dzieląca się z końcem 5 kwaśnego LZ), w stężeniu 4 nM dla każdego startera. Do amplifikacji drugiej rundy użyto pierwszego produktu jako początkowego (+) startera na pN15LZ. matryca zawierająca kwaśny motyw cDNA LZ w stężeniu 10 pM dla utworzenia chimerycznej DRB1 / LZ. Para primerów (+) 5. -ACTCGAGCCATGGTGTGTCTGAAGTTCCC-3. i (.) 5a-ACAAGCTTGCCTGAGCCAGTTCCTTTTCC-3. został następnie użyty do wzmocnienia chimery. Kaseta DRB1 / LZ została sklonowana w ramce 5. sekwencji biotynylacyjnej obecnej w wektorze pAC1 (Avidity, Denver, Colorado, USA) przy użyciu miejsc XhoI i Hindlll (podkreślone w drugiej parze primerów). Kompletną kasetę DRB1 / LZ / miejsce biotynylacji następnie amplifikowano przy użyciu pary starterów (+) 5a -AGAATTCATGGTGTGTCTGAAGTTCCC-3. i (a) 5a-CTGGTACCTTAG TGCCATTCGATTTTCTG-3 .. Fragment poddawano klonowaniu TA do pCR2.1-TOPO, sekwencjonowano, a następnie subklonowano do wektora ekspresyjnego pRmHa-3 z Drosophila, stosując miejsca EcoRI i KpnI (podkreślono). Generacja tetramerów DRA1 * 0101 / DRB1 * 0401. Chimeryczne cDNA w wektorach ekspresyjnych Schneider pRmHa-3, wraz z plazmidem pUChsneo (dar od M. McKeown, Salk Institute, San Diego, California, USA), które nosi marker oporności na neomycynę, zostały kotransfekowane do komórek Schneider S-2 (prezent od D. Zallera, Merck Research Laboratories, Rahway, New Jersey, USA) za pomocą standardowych technik transfekcji fosforanem wapnia. Komórki selekcjonowano za pomocą G418 przy 2 mg / ml. Komórki ekspandowano i hodowano do gęstości 107 komórek / ml. Dodano CuSO4 w stężeniu mM w celu zaindukowania wytwarzania rozpuszczalnych cząsteczek klasy II. Cząsteczki DR0401 oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa, stosując L243, jak opisano wcześniej (15). Cząsteczki klasy II zatężono do 2 mg / ml, a następnie dializowano wobec 10 mM Tris, pH 8,0, 10 mM NaCl. Białko następnie biotynylowano stosując enzym Bir A zgodnie z warunkami producenta (Avidity, Denver, Colorado, USA) (16). Nadmiar biotyny usunięto przez dializę. Następnie biotynylowane cząsteczki DR0401 załadowano peptydem przez inkubację przez 72 godziny w 37 ° C z 10-krotnym nadmiarem molowym reszt peptydowych hemaglutyniny 307. 319 (HA307. 319) lub resztami peptydu toksoidu tężca 830. 843 (TT830. 843). w 100 mM NaPO4, pH 5,5 i 0,2% n-oktylo-P-D-glukopiranozyd. Cząsteczki klasy II inkubowano następnie przez noc w temperaturze pokojowej z fikoerytryną (PE) -streptawidyna (BioSource International, Camarillo, Kalifornia, USA) w stosunku molowym 8: 1, aby umożliwić tworzenie tetramerycznych kompleksów peptydowych klasy II. Charakteryzowanie i barwienie klonu komórek T specyficznych dla HA307a 319. Komórki T specyficzne wobec HA307a 319 klonowano z osobnika DRB1 * 0401, DRB1 * 0101, który był immunizowany przeciw wirusowi grypy 8 miesięcy wcześniej, przez ograniczone rozcieńczenie autologicznych napromieniowanych komórek prezentujących antygen (APC), jak opisano wcześniej (17). Aby potwierdzić swoistość klonu, komórki klonalne stymulowano 10 .g / ml HA307A 319 stosując linię komórkową transfekowanego nagiego limfocyta (BLS-1), która wyraża jedyną cząsteczkę klasy II DRA1 * 0101 / DRB1 * 0401 ( 18). Włączenie 3H-tymidyny zmierzono po 72 godzinach. Komórki klonalne barwiono .g tetrameru znakowanego PE znakowanego przez 3 godziny w 37 ° C w 50 .l pożywki hodowlanej. Komórki następnie przemyto w PBS zawierającym 1% FBS i 0,1% NaN3 i wybarwiono znakowanym fluorochromem anty-CD4 (PharMingen, San Jose, Kalifornia, USA). Po 30-minutowej inkubacji komórki ponownie przemyto i analizowano za pomocą cytometru przepływowego Becton Dickinson FACSCalibur (San Jose, Kalifornia, USA). Izolacja, stymulacja i barwienie PBMC
[patrz też: peeling kwasem salicylowym, leki ratownika medycznego, parafia piotra i pawła w trzebini ]
[patrz też: parafia piotra i pawła w trzebini, stowarzyszenie charytatywne dobrosław, dieta kopenhaska przepis ]