Modele Drosophila i ssaków odkrywają rolę genu fuzji mioblastycznej TANC1 w mięśniakomięsaku prążkowanokomórkowym cd

Zatem mechanizmy, które napędzają fuzję komórek, odłączają się od sygnałów miogenicznych, które indukują różnicowanie końca miocytu. Podobnie jak genetyczne oddziaływanie PAX7-FOXO1 w Drosophila, Tanc1 było krytyczne dla patogenności PAX-FOXO1 w myoblastach ssaków. Zastosowaliśmy przenoszenie genów za pośrednictwem retrowirusów w celu wytworzenia stabilnych mioblastów C2C12 wywołujących PAX3-FOXO1, ponieważ PAX3-FOXO1 jest bardziej typową chimerą RMS i formą najczęściej profilowaną w komórkach ssaczych i potwierdziło, że poziomy misexpression białka PAX3-FOXO1 były porównywalne do ludzkie hodowane komórki PAX3-FOXO1 RMS (konkretnie, komórki RMS-13, Suplementowa Figura 5, również pokazano ekspresję Drosophila larval PAX7-FOXO1). Stwierdziliśmy, że nadekspresja Tanc1 wywołana PAX3-FOXO1 (Figura 3A) i że, podobnie jak komórki RMS, mioblasty PAX3-FOXO1 wykazywały fenotypy związane z nowotworami, w tym upośledzone różnicowanie miogenne i niezdolność do tworzenia miotub (Fig. 3, B i C, i Dodatkowa figura 6A). Jednak zmniejszenie ekspresji Tanc1 z powrotem do normalnych poziomów znacząco ograniczyło patogenność PAX3-FOXO1, ponieważ przejściowa transfekcja sharna Tanc1 do mioblastów PAX3-FOXO1 przywróciła zarówno potencjał różnicowania i fuzji (Figura 3, B i C). Warto zauważyć, że w komórkach PAX3-FOXO1 sama spinka A6 wykazała się najbardziej skuteczną ratunkiem. Analiza immunoblotów potwierdziła, że poziomy białka PAX3-FOXO1 pozostały niezmienione (Suplementalna Figura 6B). Tak więc, Tanc1 jest kluczowym efektororem dolnym PAX3-FOXO1. Figura 3 Wyciszanie TANC1 ratuje zatrzymanie różnicowania i nieudaną fuzję komórek PAX3-FOXO1 i znakuje komórki nowotworowe RMS. (ACH) Wyciszanie Tanc1 w zakażonych PAX3-FOXO1 (3 komórkach C2C12 myszy. (A) Traktowanie shRNA Tanc1 zmniejszało ekspresję Tanc1 do poziomów zbliżonych do poziomów komórek kontrolnych zakażonych GFP. Komórki traktowano połączonymi A6, A10 lub A6 i A10. (B) Komórki wyciszone w Tanc1 różnicowały się i łączono w miotubule MHC-dodatnie. Wskaźniki różnicowania i stapiania zostały obliczone tak, jak w metodach. (C) Komórki wyciszone w Tanc1 wykazały przywrócone różnicowanie i fuzję. (D. F) TANC1 wyciszanie w ludzkich komórkach RMS-13 PAX3-FOXO1. (D) ShRNA TANC1 zmniejszyło ekspresję TANC1 w porównaniu z komórkami traktowanymi shRNA GFP. (E i F) Wyciszanie TANC1 przywróciło różnicowanie i potencjał fuzyjny. (G) Immunochemia TANC1 w mięśniach szkieletowych dzieci. Rozproszone miofibry były pozytywne dla białka TANC1. (H) Immunohistochemia TANC1 silnie uwidoczniła PAX3-FOXO1 RMS. Złośliwe rabdomyoblasty (strzałki) były silnie dodatnie dla TANC1, podczas gdy przeplecione włókniako-zrąbki (groty strzałek) były ujemne. Strzałki oznaczają MHC-pozytywną tkankę syncytialną. Oryginalne powiększenie, × 400 (C i F. H); × 1,000 (H, wypustki). W A i D średnie wartości są wyświetlane powyżej słupków. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 vs. kontrola. Aby określić, czy nadekspresja Tanc1 sama zaburza fuzję mioblastów i / lub różnicowanie, ponownie wykorzystaliśmy transfer genu za pośrednictwem retrowirusów do wytworzenia komórek C2C12, które konstytutywnie nadeksprymują Tanc1 (suplementowa figura 7A). Podobnie jak komórki PAX3-FOXO1, mioblasty zakażone Tanclem były poważnie kaleczone w odniesieniu do potencjału fuzji mioblastów; jednakże, w przeciwieństwie do komórek PAX3-FOXO1, mioblasty Tanc1 różnicowały się normalnie w miocyty (Suplementowa Figura 7B). Te odkrycia ponownie pokazują, że potencjał fuzyjny można odłączyć od różnicowania terminali miocytu. Następnie zwróciliśmy się do komórek RMS-13, aby ustalić, że ludzki TANC1 wpływa na RMS. Komórki RMS-13, podobne do mioblastów RMS in vivo, wykazywały niewielką lub zerową ekspresję MHC lub potencjału fuzyjnego (Figura 3, E i F oraz Suplementowa Figura 8A). Leczenie komórek RMS-13 za pomocą shRNA. spinki do włosów A6 i A10, które są skierowane zarówno do myszy Tanc1, jak i ludzkich TANC1. ponownie zmniejszyło względną ekspresję mRNA TANC1, jak również poziomów stacjonarnych białka TANC1, podczas gdy poziomy białka PAX3-FOXO1 pozostały niezmienione (Figura 3D i dodatkowa Figura 8, A i B). Po przełączeniu na DM, mioblasty RMS-13 z wyciszonym TANC1 przeszły od wielobocznych mioblastów do komórek spindled (Supplemental Figure 8C), co sugeruje różnicowanie do miocytów. Immunofluorescencja potwierdziła, że komórki RMS-13 wyciszone przez TANC1 różnicowały się i poddawano fuzji z wytworzeniem syncytii pozytywnej pod względem MHC (Figura 3, E i F). Zgodnie z tymi ustaleniami, komórki RMS-13 z wyciszonym TANC1 wykazywały znacznie zmniejszoną onkogenność, co wykazano przez zmniejszenie wzrostu niezależnego od zakotwiczenia i tworzenie kolonii na miękkim agarze (Suplemental Fig. 8D). Na koniec, immunohistochemia wykazała, że białko TANC1 było silnie eksprymowane w nowotworach PAX3-FOXO1 RMS (n = 5, Figura 3H) w porównaniu z kontrolną tkanką mięśni szkieletowych u dzieci (n = 3; Figura 3G) [więcej w: masło z orzechów laskowych, przegladarka skierowań nfz do sanatorium, peeling kwasem salicylowym ] [podobne: kapelusz słomkowy krzyżówka, białko serwatkowe a odchudzanie, parafia płoki ]