Modele Drosophila i ssaków odkrywają rolę genu fuzji mioblastycznej TANC1 w mięśniakomięsaku prążkowanokomórkowym ad

Przetestowaliśmy 2-rolowe homozygotyczne letalne allele typu P-elementowego utraty funkcji, P1027 i P1729, do supresji PAX7-FOXO1. Spośród tych 2 alleli jedynie insercja P1729 zaburza ekspresję transkryptu rolek mioblastów (10. 12) (ekspresja rolek w komórkach mioblastów jest niezakłócona w P1027); w związku z tym tylko allel rolsP1729 tłumił PAX7-FOXO1 (3 wywoływał letalność i patogeniczność mięśni (dodatkowa Figura 2, A i B). Aby zbadać, czy rola działa jako dalszy docelowy PAX-FOXO1, użyliśmy transgenu bez córki-Gal4 (powszechnie stosowanego w Drosophila do kierowania silną ekspresją transgenów UAS we wszystkich komórkach podczas rozwoju), aby stymulować wszechobecną ekspresję embrionalną UAS-PAX7-FOXO1 i sondowane pod kątem misexpression Rols. Ponieważ natywna ekspresja Rols rozpoczyna się w stadium embrionalnym 11 (10-12), skupiliśmy się tylko na zarodkach etapu 10 lub wcześniejszych. Rozproszoną ekspresję PAX7-FOXO1 i Rols obserwowano w zarodkach blastodermy (stadium 4-5) (Figura 1), które składają się z niezakończonych komórek prekursorowych, a ekspresja utrzymywała się we wszystkich badanych komórkach. w tym niemiogenne komórki ektodermalne i endodermalne. zrogowaciałych (stadium 9-10) zarodków (dodatkowa Figura 3, A. D). Podsumowując, te badania Drosophila ujawniły, że rola działa jako docelowy gen PAX7-FOXO1, bezpośredni lub pośredni, oraz jako skuteczny genetyczny efektor. Figura 1PAX7-FOXO1 indukuje Misexpression Rols w Drosophila. Całe zarodki dzikich i bez córek Gal, UAS-PAX7-FOXO1 (da >> PAX7-FOXO1) zarodków blastodermy (przedni biegun) były wybarwione anty-PAX7-FOXO1 i anty-Rols (czerwone), a jądra były wybarwione z DAPI (niebieski). Zarodki typu dzikiego nie wykazywały ekspresji białka PAX7-FOXO1 lub Rols; bez córki-Gal, zarodki UAS-PAX7-FOXO1 wykazywały ekspresję PAX7-FOXO1 (czynnik transkrypcyjny) i Rols (cząsteczka adaptacyjna cytoplazmatyczna): podczas gdy ta ostatnia była wykluczona z jądra, pierwsza znajdowała się zarówno w cytoplazmie, jak iw jądrach. Oryginalne powiększenie, × 800. Aby rozszerzyć nasze badania z Drosophila na ssaki, najpierw zakwestionowaliśmy, czy rola aktywności fuzji mioblastów jest ewolucyjnie konserwowana. U ssaków występują 2 ortologi rol, powtórzeń tetratricopeptide, ankyrin-repeat, coiled-cewka (Tanc1) i Tanc2, z których żadna nie była badana w mięśniach. Ponieważ tylko Tanc1 jest wyrażany w somitach, gdy występuje fuzja mioblastów (12), postawiliśmy hipotezę, że Tanc1 jest funkcjonalnym ortologiem. Zwróciliśmy się do myoblastów hodowanych w C2C12 myszy, które po przejściu z podłoża wzrostowego do różnicowania (DM) różnicują się i łączą tworząc syncytialne miotubule. Ilościowy RT-PCR (qRT-PCR) potwierdził, że Tanc1 był eksprymowany w komórkach C2C12 (Figura 2A) i że względne poziomy ekspresji zmniejszyły się o 40% w miarę postępowania różnicowania (dodatkowa Figura 4). Rycina 2 Tanc1 jest niezbędna do fuzji mioblastów, ale nie do różnicowania miogennego. (A) qRT-PCR potwierdziło zależne od shRNA wyciszanie myszy Tanc1 (mTanc1). Po 72 godzinach przejściowej transfekcji, konstrukty A6 i A10 testowano indywidualnie i w połączeniu i porównano z komórkami kontrolnymi transfekowanymi spinką GFP. Poziomy mRNA Tanc1 znormalizowano do P-aktyny, która nie zmieniła się w trakcie różnicowania. Wartości średnie są wyświetlane powyżej słupków. (B) Uciszenie Tanc1 zablokowało fuzję mioblastów. Wskaźniki fuzyjne obliczono (patrz Metody) dla komórek transfekowanych spinkami do włosów Tanc1 lub spinką kontrolną GFP. (C) Mioblasty wycięte w Tanc1 zróżnicowane do miocytów MHC-dodatnich. Wskaźniki różnicowania obliczono dla komórek C2C12 traktowanych spinkami Tanc1 lub spinką GFP. (D) Barwienie fioletem krystalicznym komórek C2C12 typu dzikiego i komórek wyciszonych Tanc1 z uszkodzeniem fuzyjnym. Strzałki oznaczają resztkowe cząstki barwnika. (E) Niefuzowane komórki C2C12 wyciszone Tanc1 różnicowały się na miocyty MHC-dodatnie. Komórki wybarwiono przeciwciałem MF-20 i DAPI. Dla wszystkich transfekcji użyto łącznie 10 .g DNA. Oryginalne powiększenie, × 400 (D i E). *** P <0,001 vs. kontrola. Następnie użyliśmy shRNAs, aby ustalić, że aktywność Tanc1 jest niezbędna do tworzenia się miotubuli. Testowaliśmy 2 oddzielne konstrukty, A6 i A10, pojedynczo i w kombinacji, i stosowano qRT-PCR w celu potwierdzenia knockdown mRNA (Figura 2A). Wyciszanie Tanc1 silnie blokuje tworzenie syncytialnych miotubul w sposób zależny od dawki (Figura 2, B, D i E). Komórki wyciszone przez Tanc1 nadal jednak przechodzą od okrągłych prekursorów do komórek w kształcie wrzeciona (Figura 2, D i E), co sugeruje udane różnicowanie miocytów. Immunofluorescencja dla ciężkiego łańcucha miozyny swoistej dla mięśni (MHC, marker końcowego różnicowania) potwierdziła, że mioblasty traktowane Tanc1 traktowane sukcesem przeszły do stanu zróżnicowanego (Figura 2, C i E) [przypisy: dieta kopenhaska przepis, soczewki kontaktowe miesięczne, niewydolność nerek objawy ] [patrz też: rehabilitacja po szyciu łąkotki, truskawki indeks glikemiczny, parafia trzebinia siersza ]