maria rzemieniuk olkusz

Całkowita ekspresja sLex na powierzchni komórek była znacznie zwiększona w hiPS-HSPCs transfekowanych zmodyfikowanymi mRNA kodującymi FUT6 i FUT7, ale nie FUT3 (Figura 2B). Aby dokładnie wizualizować glikoproteiny wiążące się z E-selektyną, przeprowadziliśmy analizę Western blot przy użyciu chimery E-selektyny Ig jako sondy (Figura 2C). Zmodyfikowane przez FUT6 transfekowane mRNA p hiPS-HSPC miały wyższe poziomy glikoprotein wiążących E-selektynę niż modyfikowane mRNA FUT3, mRNA A zmodyfikowane FUT7 lub pozornie transfekowane hiPS-HSPC (Figura 2C). Ponieważ wiadomo, że glikoproteiny zawierające sLex odgrywają kluczową rolę w transporcie komórkowym, mRNA zmodyfikowane FUT6 wykorzystano do wszystkich dalszych doświadczeń. Zmodyfikowana FUT6 transfekcja mRNA konsekwentnie i silnie zwiększona ekspresja sLex hiPS-HSPC w wielu niezależnych eksperymentach (Supplemental Figure 2E). Analiza przebiegu w czasie zmodyfikowanych mRNA HST transfekowanych hiPS-HSPC wykazała, że ekspresja sLex osiąga wartość od 24 do 72 godzin po transfekcji i następnie maleje (suplement 2F). Nie zaobserwowano szkodliwego wpływu na różnicowanie krwiotwórcze lub aktywność tworzenia kolonii (Suplementowa Figura 2, G. I). Łącznie, te dane wskazują, że transfekcja mRNA zmodyfikowana FUT6 jest skuteczną strategią do generowania ligandów selektyny E w hiPS-HSPC. Figura 2 Modyfikowana za pomocą mRNA glyc glikoinżynieria modyfikowana FUT6 wzmaga tethering i toczenie hiPS-HSPC na komórkach śródbłonka w warunkach ścinania. (A) Reprezentatywne histogramy pokazujące ekspresję sLex na hiPS-HSPC i komórkach kontrolnych PBMC mierzonych przeciwciałem HECA452. (B) Reprezentatywne histogramy pokazujące ekspresję sLex na hiPS-HSPC 24 godziny po transfekcji zmodyfikowanymi mRNA kodującymi FUT3, FUT6 i FUT7. (C) Western blot z chimerą E-selektyny Ig lub (3-aktyną (kontrola obciążenia) na lizatach komórek hiPS-HSPC pozornie transfekowano lub transfekowano wskazanymi zmodyfikowanymi mRNA 2 dni wcześniej. (D) Oznaczanie ilościowe za pośrednictwem E-selektyny toczenia kontrolnego lub zmodyfikowane FUT6 mRNA transBPS hiPS-HSPC na HUVEC aktywowanych TNF-a przy rosnącym naprężeniu ścinającym. Przeciwciało blokujące e-selektynę zmniejsza walcowanie do linii podstawowej, podczas gdy nie obserwowano interakcji w komórkach HUVEC nieaktywowanych za pomocą TNF-a. n = 3. (E) zmodyfikowane FUT6 transfekowane mRNA p hiPS-HSPC wykazują zmniejszone prędkości walcowania na aktywowanych TNF – aktywowanymi HUVEC. n = 3. Paski błędów wskazują SEM. * P <0,05, ** P <0,01 według testu ucznia. W celu określenia, czy zwiększona reaktywność sLex i E-selektyniny Ig odpowiada czynnościowej aktywności wiązania E-selektyny, przetestowaliśmy zdolność zmodyfikowanych FUT6 mRNA transBPS hiPS-HSPC do uwięzienia i zrolowania w warunkach płynnego ścinania HUVEC aktywowanego TNF-a. jednowarstwowe z równoległą płytkową komorą przepływową. Zmodyfikowane przez FUT6 transfekowane mRNA p hiPS-HSPC wykazywały coraz większą liczbę toczących się komórek z rosnącym naprężeniem ścinającym, w przeciwieństwie do komórek kontrolnych, które utrzymywały jednolicie niskie poziomy ruchomych komórek (figura 2D i suplement 1). Ponadto prędkości toczenia były znacznie niższe w zmodyfikowanych FUT6 mRNA a transfekowanych hiPS-HSPC, co wskazuje na zwiększone wiązanie liganda E-selektyny (Figura 2E). Blokowanie E-selektyny lub wstrzymywanie TNF-a aktywacja zmniejszyła liczbę toczących się komórek transfekowanych zmodyfikowanym mRNA FUT6, potwierdzając, że ich zmienione właściwości toczne są mediowane wyłącznie przez zwiększoną aktywność ligandu E-selektyny (Figura 2D i Suplementacja wideo 2). Dane te pokazują, że modyfikowana FUT6 inżynieria glikomodyfikacyjna mRNA wytwarza funkcjonalne ligandy E-selektyny na hiPS-HSPC i pośredniczy w zwiększonych oddziaływaniu tetheringu i toczenia na aktywowanym śródbłonku. W celu określenia, czy zwiększona ekspresja ligandu E-selektyny wywołana przez mRNA zmodyfikowany FUT6 jest funkcjonalnie istotna in vivo, oceniliśmy homoanalizowanie BM hiPS-HSPC in vivo za pomocą obrazowania BM z użyciem kalwinii (Figura 3). Kontrolowane lub zmodyfikowane FUT6 transfekowane mRNA a hiPS-HSPC zabarwione DiI lub DiD zostały wspólnie wstrzyknięte myszom NSG, a kalibię zobrazowano przy użyciu mikroskopii w jamie ustnej w celu pomiaru bazowania BM (Figura 3, ACH). Obrazowanie i oznaczanie wyznakowanych komórek 2 godziny po przeszczepie wykazało, że transfekowane mRNA hlPS-HSPC zmodyfikowane FUT6 wykazywały znaczny wzrost bazowania w porównaniu z komórkami transfekowanymi kontrolnie (Figura 3C). Wynaczynienie oceniano przez znakowanie naczyń krwionośnych barwnikiem naczyniowym i oznaczanie ilościowe liczby hiPS-HSPC, które wyemigrowały z naczynia krwionośnego 24 godziny po przeszczepie (Figura 3D). Badania te ujawniły, że transfekowane mRNA hPS transfekowane FUT6 hiPS-HSPC znacznie zwiększyły częstość wynaczynienia w porównaniu z komórkami traktowanymi kontrolnie przy użyciu przeszczepu (Figura 3E). Aby ustalić bezwzględną wydajność homingów zmodyfikowanych mRNA h transfekowanych hiPS-HSPC, przeprowadziliśmy krótkoterminowe eksperymenty bazowania na BM, porównując zmodyfikowane FUT6 mRNA transPS i hiPS-HSPC z komórkami CD34 + ze zmobilizowanej krwi obwodowej (komórki CD34 + mPB) (Suplementowa Figura 4). , A i B) [podobne: leki ratownika medycznego, chłoniak z komórek płaszcza, korekcja nosa kwasem hialuronowym ] [przypisy: koralina cda, jak ugotowac kasze jaglana, zielony jęczmień skutki uboczne ]