bezglutenowe zboże

Różnicowanie hematopoetyczne było podobnie wysoce skuteczne w wielu ludzkich liniach PSC, w tym dwóch liniach ESC i iPSC uzyskanych od pacjenta z zespołem Pearsona (Supplemental Figure 1E). Zgodnie z ich pozyskaniem prymitywnych markerów krwiotwórczych, ludzkie komórki krwiotwórcze pochodzące z iPSC posiadały silną aktywność progenitorową (Suplementowa Figura 1, F i G), i nazwaliśmy te komórki HSPC pochodzenia ludzkiego iPSC (hiPS-HSPC). Następnie przystąpiliśmy do badania na hiPS-HSPC cząsteczek znanych z pośredniczenia w wynaczynieniu BM i w dostarczaniu szpiku ludzkich ludzkich HSPC. Najpierw oceniliśmy ekspresję CXCR4 receptora SDF-1 i receptora hALuronowego CD44 (8) i zaobserwowaliśmy, że hiPS-HSPC wyrażają umiarkowane do wysokich poziomów tych cząsteczek (Figura 1A). Funkcję CXCR4 potwierdzono w analizach migracji przez transwell, gdzie hiPS-HSPC wykazały znacznie zwiększoną aktywność transmigracji w kierunku gradientu SDF-1, aktywności całkowicie zablokowanej przez antagonistę CXCR4 AMD3100 (Figura 1B). Następnie oceniliśmy ekspresję podjednostek integryny, które stanowią VLA-4 i VLA-5, ponieważ VLA-4 ma kluczowe znaczenie dla wynaczynienia HSPC, a zarówno VLA-4, jak i VLA-5 pośredniczą w wiązaniu się z fibronektyną, kluczowym mediatorem składania HSPC. HiPS-HSPC wyrażały silne poziomy podjednostek integryny VLA-4. 4 i. i umiarkowaną ekspresję. 5 (figura 1C), która razem z a1 stanowi VLA-5 (9). Wiadomo, że dimery integrin istnieją w trzech różnych konformacjach: gięte-zamknięte (nieaktywne), rozszerzone-zamknięte (zagruntowane) i rozszerzone-otwarte (aktywne) (10). Aktywacja integryn, kanonicznie za pomocą sprzężenia CXCR4 (indukowana sygnalizacja SDF-1 (3), ma decydujące znaczenie dla umożliwienia ich funkcji jako mediatorów wywoływania naprowadzania i szpiku (11). Aby ocenić stan aktywacji integryny hiPS-HSPC na linii podstawowej i w odpowiedzi na SDF-1, użyliśmy przeciwciał specyficznych względem aktywacji do podjednostki a integryny, co jest wspólne dla VLA-4 i VLA-5 (Figura 1D). Ta analiza ujawniła, że hiPS-HSPC natywnie prezentują integryny. w konformacji o rozszerzonym zamknięciu (primed). Ponadto, integryny a1 przekształcono w konformację o przedłużonym otwarciu (aktywnej) przez indukowane sygnałem SDF-1 (3 do poziomów porównywalnych z komórkami eksponowanymi na mangan, silny niezależny od sygnalizacji aktywator integryny (Figura 1D). Łącznie, te dane wskazują, że hiPS-HSPC wyrażają znaczące poziomy CD44, CXCR4, VLA-4 i VLA-5, oraz że te mediatory wynaczynienia i tworzenia działają normalnie w tych komórkach. Figura 1hiPS-HSPC posiada cząsteczki pośredniczące w wynaczynieniu. (A) Reprezentatywne histogramy pokazujące ekspresję CXCR4 i CD44 na hiPS-HSPC i kontrolne komórki RPMI8402. (B) Znormalizowana aktywność transmigracji hiPS-HSPC i kontrola ludzkich PBMC w odpowiedzi na SDF-1. Antagonista CXCR4 (AMD3100) stosowany do potwierdzenia migracji był mediowany przez CXCR4. n = 3. (C) Reprezentatywne histogramy pokazujące ekspresję podjednostek a1, a4, a5 integryny na hiPS-HSPC i kontrolnych komórkach Jurkat. (D) Aktywacja aktywatora integryny a1 hiPS-HSPC stymulowana SDF-1 lub MnCl2 z wielu eksperymentów. 4B4, wszystkie konformacje a1; N29, pierwotna konformacja a1; HUTS4, konformacja aktywna a 1. n = 4. 6; ** P <0,01, *** P <0,001; NS, nieistotny dla 1-drogowej ANOVA z testem HSD Tukeya. Paski błędów wskazują SEM. Następnie analizowaliśmy ekspresję ligandu E-selektyny przy użyciu HECA452, przeciwciała, które wykrywa glikan tetrasacharydowy znany jako sialyl Lewis X (sLex), determinanta kanonicznego wiązania liganda E-selektyny (12). Co uderzające, hiPS-HSPC miały bardzo niską ekspresję sLex w porównaniu z kontrolnymi jednojądrzastymi komórkami krwi obwodowej (PBMC) (Figura 2A). Aby określić, czy ta niska ekspresja sLex była protokołem różnicowania. lub specyficzną dla linii komórkowej, oceniano ekspresję sLex na HSPCS pochodzącym z iPSC zgodnie z dwoma alternatywnymi opublikowanymi protokołami (6, 13), jak również HSPC pochodzącymi z dwóch różnych linii ESC. Bramkowanie przypuszczalnych HSPC, jak opisano w odpowiednich opublikowanych protokołach (Suplementowa Figura 2A), obserwowaliśmy podobnie niskie poziomy sLex badanych populacji (Suplementowa Figura 2, B i C). Brak ekspresji ligandu E-selektyny skłonił nas do postawienia hipotezy, że zwiększenie ekspresji ligandu E-selektyny może spowodować zwiększenie zasiedlania tych komórek po przeszczepie. Na podstawie wcześniejszych doświadczeń w innych typach komórek (14), przewidywaliśmy, że hiPS-HSPC mogą wyrażać sLex po fukozylacji z (3- (1,3)-fukozylotransferazą. W związku z tym wygenerowaliśmy zmodyfikowane mRNA (7) kodujące 3 ludzkie a (1,3) fukozylotransferazy (określane dalej jako mRNA zmodyfikowane FUT3, FUT6 i FUT7, suplekowa figura 2D) i transfekowano je do hiPS-HSPC (dodatkowa figura 3). [hasła pokrewne: pasta tahini gdzie kupić, aspergiloza, truskawki indeks glikemiczny ] [przypisy: parafia trzebinia, aspergiloza, krem z groszku kwestia smaku ]